据中国激光杂志社网，于2023年10月23日报道， 在纳米尺度下观察三维亚细胞结构对于生物医学研究和其他多学科研究具有至关重要的意义。为了突破固有的衍射极限，横向超分辨率显微镜应运而生，分辨率达到亚100甚至亚50 nm。
为了进一步提高轴向分辨率，过去几十年中人们已开发出多种方法在现有二维超分辨技术的基础上实现三维超分辨。其中，受激发射耗尽显微镜（STED）和单分子定位显微镜（SMLM）经过优化和改进能显著提高轴向分辨率。3D-STED系列技术通过调制耗尽光束的相位来生成一个中心强度为零的三维耗尽光斑，从而导致周围荧光发射呈非线性耗尽，并在三维范围内实现更小的发射模式；而3D-SMLM系列技术则引入了点扩散函数工程、自适应光学和多平面检测等方法来提高轴向分辨率。通过在每次采集中使荧光分子稀疏发光，并定位亚衍射极限范围内每个荧光分子的三维位置来实现这一目标。
虽然少数3D-STED和3D-SMLM技术可以达到大约30-50 nm的相对理想轴向分辨率，但这通常需要具有高功率密度的激光器来产生设计的光束模式或保证足够强度的荧光信号。然而，符合条件的激光器会引起严重的光漂白和光毒性，并限制了对动态活细胞样本进行长期观察的能力。近年来已有一些相关报道采用低功率激光的方法，但在这些技术中，调整荧光染料和成像缓冲液的过程仍显繁琐，限制了其广泛应用。此外，采用长时程图像采集的手段导致时间分辨率降低也是一个不可忽视的缺陷。
研究内容与方法
针对上述问题，来自浙江大学的匡翠方教授和香港中文大学的周仁杰教授联合在Advanced Photonics 2023年第5期上发表题为“Fluorescence Interference Structured Illumination Microscopy for 3D morphology imaging with high axial resolution”的文章。该工作报告了一种新型成像方法——荧光干涉结构光照明显微镜（Fluorescence Interference Structured Illumination Microscopy，FI-SIM），用于实现对亚细胞结构和形态的动态成像。该方法融合了3D-SIM和荧光干涉轴向重建技术，能够快速准确地进行三维成像，无需z轴扫描，这是其他超分辨技术所不具备的优势。因此，该方法可通过荧光干涉和相位展开实现精确的轴向重建，并对微观结构进行薄光学切片处理，从而成为研究细胞精细结构形态与活动的极具前景的手段。
激发光束通过干涉调制模块进行分束，该模块包含galvo-mirrors和压电平台，以形成三束辐照模式（three-beam illumination mode，3D-SIM）；来自上下物镜收集的荧光发生干涉，通过相位调制和路径分离模块的调控，荧光被分束为四个通道(包括两个s偏振和两个p偏振通道)；代表四个不同的相位编码样品的深度信息。这些图像由sCMOS收集，并且所有设备都由计算机同步控制（图1a）。研究人员选择通过单个物镜激发样品，并通过4Pi结构进行探测（图1b）。
为了验证该方法在实际应用中的性能，研究人员进行了一系列的实验。首先测试BSC细胞的固定微管网络。通过对每个通道采集15张图像，在0.75 s内(每次采集曝光时间为35 ms)可采集多达60张图像。随后进行3D-SIM恢复和轴向重建，获得3D超分辨率形态学图像。通过对图像中的结构进行分割，将SIM图像的空间掩模应用于轴向重建。根据荧光干涉相位来获取每个ROI的轴向位置，并以深度编码可视化和3D形式显示（如图2(b)、(d)所示）。研究人员测量了从细胞边缘到中心(细胞核)沿轴向连续变化的弯曲微管网络的生长和分布。在重建图像堆栈和轴向截面（图2(b)、(e)）中可以清晰观察到重建的体轴向分辨率约为30 nm。
为了验证FI-SIM探索微观世界的能力，研究人员对活的U2OS细胞中的微管和线粒体进行了成像。该工作通过对U2OS细胞染色，对这些活细胞进行成像。重建的三维图像清晰地显示出微管和线粒体分别在轴向260 nm和120 nm范围内的分布（图3）。
为了验证FI-SIM在快速图像获取方面的性能，研究人员在0.75 s/volume的时间分辨率和35 ms的曝光时间的条件下，获取了活体L929细胞中迁移体的连续FI-SIM图像序列（图4）。为了便于在短时间内展示迁移体的轴向运动，图5中呈现了每隔5帧（即3.75 s）的FI-SIM图像。在15 s内，可以明显观察到由于L929细胞的迁移引起的迁移体在FI-SIM图像序列中发生的显著轴向变化。这也表明迁移体在细胞产生后并不是固定的，而是快速变化并参与细胞生命活动的。
总结与展望
该工作报道了一种新型成像模式——荧光干涉结构照明显微镜，它基于3D-SIM进行宽场成像和荧光干涉进行轴向重建。FI-SIM能够在数百毫秒内快速获取图像，并且在不需要z轴扫描的情况下，在半波长深度范围内展现出30 nm甚至更好的轴向分辨率。此外，相对较低的激光功率密度降低了对染料的要求，并可广泛应用于观察亚细胞结构。
