据中国激光杂志社网，于2023年09月30日报道，融合超分辨结构光照明显微术（SIM）和荧光共振能量转移（FRET）显微成像术，发展活细胞超分辨SIM-FRET成像分析技术，为实时观测亚细胞器精细结构上生物大分子间的相互作用机制、复合大分子结构信息及其功能提供了新的技术手段。SIM由于其算法中的固有缺陷造成超分辨图像中常出现重构伪影，使SIM图像的保真度经常受到质疑，解决SIM图像重建伪影和定量FRET成像的矛盾成为发展超分辨SIM-FRET成像技术的关键问题。
SIM-FRET通常使用线性Wiener反卷积进行超分辨图像重建，然而，Wiener-SIM无法完全消除频谱搬移后的等效光学传递函数 （OTF）失真，最终导致重建图像受到旁瓣伪影和残余背景荧光的影响，影响定量分析的准确性。2021年，中国科学院苏州医工所李辉研究员团队提出了一种基于频谱优化的高保真SIM重构算法（HiFi-SIM），该算法在保留图像细节的前提下有效去除了图像结构中旁瓣伪影，但 HiFi-SIM的两步频谱优化可能导致不同发射波长下重建图像灰度产生不一致的强度变化，进而影响HiFi-SIM FRET定量分析结果的准确性。
针对上述问题，华南师范大学生物光子学研究院陈同生教授团队发展了一种基于高保真HiFi-SIM重构框架的超分辨率定量SIM-FRET重构算法（HiFi-SO-SIM-FRET）。该方法在保持HiFi-SIM重构算法对图像结构的高保真性的同时，通过FRET约束条件自适应地调整HiFi-SIM复合滤波器的参数，确保定量FRET分析对通道间重建图像灰度保真度的要求，从而补偿了HiFi-SIM与FRET结合时由于三个通道的相对强度值变化不一致而引入的偏差结果。相关成果以“High-fidelity SIM reconstruction-based super-resolution quantitative FRET imaging”为题，发表在Advanced Photonics Nexus 2023年第5期上。
HiFi-SO-SIM-FRET算法主要包含两个步骤：（1）基于高保真HiFi-SIM重构框架的FRET三通道图像频谱优化重建；（2）对FRET三通道重建图像进行背景扣除和通道掩膜后计算FRET效率ED和供体浓度比RC。通过优化参数来最小化HiFi-SIM在不同FRET通道复合滤波器与相应Wiener-SIM的复合滤波器的比率，HiFi-SO-SIM-FRET可以实现保持HiFi-SIM复合滤波器对伪影抑制能力的同时保持FRET三通道图像的相对灰度关系（图1（b-c））。
研究人员在活细胞样本中验证了HiFi-SO-SIM-FRET超分辨定量FRET分析能力。如图2所示，在MCF-7细胞样本中使用表达靶向线粒体外膜的FRET标准质粒（ActA-G17M）进行了测试，与Wiener-SIM相比，HiFi-SO-SIM-FRET能够有效减少旁瓣伪影和残余背景荧光对定量FRET分析的影响（图2（c，h））。此外，HiFi-SO-SIM-FRET成功地区分了在Wiener-SIM FRET无法分辨的环状结构（图2（b，e））。
定量FRET分析结果表明，HiFi-SO-SIM-FRET成功地纠正了HiFi-SIM与FRET直接结合所产生的FRET效率ED和受供体浓度比RC的误差，其结果与宽场和Wiener-SIM的结果没有统计学上的差异，并且与先验的FRET表观效率（ED=0.2）以及受体与供体的浓度比（RC=1）一致（图3）。这进一步验证了HiFi-SO-SIM-FRET在定量FRET计算方法中的准确性。
研究团队认为，HiFi-SO-SIM-FRET能够实现在更低背景和重建伪影的情况下进行超分辨定量FRET分析。这一成果有望应用于研究活细胞中细胞核、线粒体和内质网等精细结构上的分子结构及其功能。
华南师范大学生物光子学研究院博士研究生罗泽伟和硕士研究生臧国栋为文章的共同第一作者。作者感谢中科院苏州医工所李辉教授和文刚博士对本文的宝贵意见。该项工作得到了国家自然科学基金重点项目(批准号：62135003)、广东省重点领域研发计划“精密仪器设备”专题项目 (批准号：2022B0303040003) 的支持。
通讯作者简介
陈同生，华南师范大学生物光子学研究院院长，二级教授、博士生导师，高层次人才特殊计划领军人才，生物光子学学科带头人，广东省激光生命科学重点实验室主任。建立了系统的活细胞分子结构与功能成像分析理论，研发了国际上首台智能定量FRET成像分析系统。主持国家重大科研仪器研制项目、国家基金委重点项目和广东省重点领域研发计划等20余项。曾获湖北省自然科学二等奖、广东省科学技术奖二等奖，发表SCI收录论文160余篇，获批国家授权发明专利20余项。
