据中国激光杂志社网，于2023年12月18日报道，  1665年，Robert Hooke利用自制的光学显微镜观察了软木薄片，并将木栓组织中的规则小室命名为“cell”，随后获取了各种镜下图像，自此掀起了人们对光学显微成像技术的研发浪潮。在众多光学显微技术中，最具代表性的荧光成像已然成为多学科研究中的重要工具。但由于荧光分子的宽光谱特性，在复杂系统的多色标记应用（如多细胞器互作，组织微环境）上有所局限。基于分子振动跃迁、具有窄谱线宽度的受激拉曼散射（SRS）显微技术则展示出优越的超多色复用能力[1,2]，但SRS的空间分辨率受到激发光衍射极限的桎梏，通常仅为350 nm，对精细结构的解析存在技术难点。因此，对亚百纳米空间分辨的SRS显微镜的研发将进一步推动超多色、超分辨成像技术的发展。

        近日，复旦大学季敏标教授课题组联合南方科技大学吴长锋教授课题组开展技术攻关，在此前可逆光开关SRS成像工作[3]的基础上，借鉴可逆饱和/开关荧光跃迁（RESOLFT）超分辨技术中的点扩散函数（PSF）压缩策略，在体外和活细胞中实现了亚100 nm的超分辨率SRS成像。相对于传统SRS成像，该技术的分辨率提高了约4倍。研究成果为开发具有振动超多色复用潜力的超分辨成像技术提供了可能。相关成果以“Photoswitchable vibrational nanoscopy with sub-100 nm optical resolution”为题，发表在Advanced Photonics 2023年第6期[4]。

       另辟蹊径：实现新型超分辨SRS显微镜   

       本研究开发的新型超分辨SRS显微系统如图2（a）所示，具体包括：以泵浦光与斯托克斯光共振激发特定的拉曼频率，以高斯型的紫外光（360 nm）和环型可见光（633 nm）对光异构分子（DTE-Ph）进行炔基的拉曼频率调控，使之仅在甜甜圈中心区域处在共振峰位，进而实现有效PSF的空间整形。图2（b）展示了涡旋玻片 (VR)将可见光由高斯光束转换为“空心孔型”的中空强度分布；图2（c）通过单个金纳米颗粒表征了激光扫描显微镜下的可见光和紫外光的PSF；图2（d）显示了可逆光异构分子在可见光抑制和紫外光激活状态下的SRS共振跃迁机理。

       见微才可知著：突破100纳米分辨率！

       为了表征超分辨 SRS 能够达到的最佳分辨率，我们采用最普遍的方法——对离散的亚分辨率尺寸的小球进行成像，通过小球图像截面的半高全宽定义空间分辨率。如图3（a-b）所示，研究将可逆光异构分子合成为纳米颗粒（DTE-Ph @ NPs），其平均直径约为18 nm。图3（c-f）展示了传统SRS和新型超分辨SRS模式下的DTE-Ph @ NPs对比图像，可见超分辨模式下的颗粒更加精细清晰。图3（g）的PSF分布统计结果表明超分辨SRS的空间分辨率相较于传统SRS有4倍的提升。此外，将纳米颗粒喂食给HeLa细胞，在细胞内的超分辨成像实验进一步证明了该方法在生物成像方面的应用普适性。

        总结与展望

        与电子显微镜等有损技术相比，细胞生物学研究通常更青睐光学成像方法，因为光学成像具有非破坏性，与生命系统的动态观察兼容，而相对较低的空间分辨率限制了对精细结构的解析。提高光学显微镜的分辨率长期以来是人们追求的目标。尽管荧光超分辨技术已经取得了巨大的成功，但更具光谱特异性的振动成像要达到亚衍射极限仍然具有挑战性。研究人员通过将炔基与光致变色分子偶联，设计出了高灵敏的光开关拉曼探针；并构建了超分辨SRS成像系统，在体外及细胞层面上表征了超分辨的效果。后续可借助同位素/侧链修饰等方式进一步优化并开发更多具有不同拉曼频率的可逆光开关探针，有望实现超分辨超多色受激拉曼成像，为复杂系统的精细研究提供帮助。